子宫内膜异位症（EM）是育龄女性常见疾病，在不孕女性中发病率为20%-50%，EM患者不孕风险是无EM者的4 倍，但EM相关不孕机制尚未完全阐明，目前认为卵泡发育异常和卵母细胞质量下降是主要诱因。氧化应激是导致EM患者卵泡发育异常和卵母细胞质量降低的重要因素，可通过抑制线粒体功能、干扰脂质代谢、加速颗粒细胞（GCs）衰老等损害卵母细胞数量和质量；GCs作为卵泡重要组成，通过缝隙连接和旁分泌为卵母细胞提供营养和能量，其衰老与EM相关不孕密切相关。
2025年8月，浙江大学医学院附属邵逸夫医院张松英、戴永东、周枫共同通讯在Advanced Science (IF 14.1)在线发表题为“EETs Reduction Contributes to Granulosa Cell Senescence and Endometriosis-Associated Infertility via the PI3K/AKT/mTOR Signaling Pathway”的研究论文。首次系统阐明EM相关不孕中的氧化脂质谱，明确14,15-EET的抗GC衰老作用，揭示 ROS-EZH2/H3K27Me3-EPHX2-EET恶性循环机制，为EM相关不孕提供新治疗靶点，并证实了TPPU和BEZ-235的潜在治疗价值。
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基因信息
EZH2：组蛋白甲基转移酶
EPHX2：可溶性环氧化物水解酶
病毒产品
LV-sh-EZH2、LV-sh-EPHX2、LV-sh-NC ;
LV-EZH2、LV-EPHX2、LV-NC
感染细胞
小鼠卵巢颗粒细胞（mGC）
MOI
10
WB检测LV-sh-EZH2、LV-sh-EPHX2的敲低效果
研究结果
1、Ezh2活性降低通过减少Ephx2基因启动子的H3K27Me3修饰上调EPHX2表达水平
研究人员通过对不孕妇女的卵泡液（FF）、腹膜液 (PF) 和卵巢颗粒细胞 (GC) 进行LC-MS/MS分析，发现氧化脂质14,15-EET水平在EM患者中显著下降，并与IVF结局呈正相关。使用14,15 EET预处理可通过提高mGCs的抗氧化能力和ATP水平，减轻过度氧化应激引起的线粒体功能障碍和ROS诱导的卵巢GC衰老。EETs由花生四烯酸（AA）经细胞色素P450单加氧酶（如CYP3A5）合成，再通过可溶性环氧化物水解酶（EPHX2）代谢为低活性的DHETs。研究发现，EM-GCs与Con-GCs中，CYP3A5的mRNA表达水平无显著差异；但EPHX2的mRNA和蛋白表达水平均显著升高，提示EM患者卵泡液中EETs减少源于EPHX2介导的代谢增加，而非合成异常。EM-GCs中，组蛋白甲基转移酶EZH2的蛋白表达水平显著低于Con-GCs，同时其催化产生的抑制性组蛋白修饰标志物H3K27Me3水平也显著下降；而细胞衰老标志物蛋白P21的表达水平显著升高，暗示EZH2/H3K27Me3下调与EM-GCs衰老及EPHX2上调存在关联。通过慢病毒介导的Sh-EZH2敲低mGCs中EZH2表达后，qRT-PCR结果显示Ezh2 mRNA水平显著降低，而Ephx2 mRNA水平显著升高；Western blot同样证实Sh-EZH2处理组的EZH2蛋白水平降低，EPHX2蛋白水平显著升高。ChIP-PCR进一步验证H3K27Me3与EPHX2启动子的结合，表明EM-GC中Ezh 2活性下降导致Ephx2启动子区域基于H3K27Me3的组蛋白甲基化减少，从而导致EPHX2蛋白表达水平增加，促进14,15-EET代谢，最终降低EM卵泡中14,15-EET水平。
EZH2/H3K27Me3组蛋白甲基化降低导致EM-GCs中EPHX2表达水平升高
2、EPHX2过表达加剧卵巢GC衰老，而其抑制剂TPPU减轻ROS诱导的细胞衰老
在诱导氧化应激后过表达EZH2，导致EPHX2和衰老标记蛋白的表达水平降低。有趣的是，在氧化应激条件下，EPHX2敲低上调EZH2/H3K27Me3表达水平，但抑制衰老标记蛋白表达水平。此外，EPHX2敲低显著升高14,15-EET浓度，并逆转ROS诱导的GC衰老表型。进一步在体外过表达EPHX2会加剧GCs衰老，而其特异性抑制剂TPPU可通过上调EETs水平，缓解ROS诱导的GCs衰老。接下来，研究团队建立EM小鼠模型，探索了TPPU处理（验证了无明显毒性）是否可以影响体内细胞衰老，结果显示TPPU可上调EM小鼠GCs中EETs、EZH2及H3K27Me3水平，降低EPHX2及衰老标记蛋白的表达水平。这些数据表明TPPU在减轻体内mGC衰老中的重要作用，该功能可能通过上调EET水平来实现。进一步研究证实TPPU处理可延缓EM小鼠生育能力下降，通过调控卵巢微环境，显著改善卵丘-卵母细胞复合体（COC）的扩张异常，并抑制卵母细胞中活性氧的积累。
EPHX2过表达加重mGC衰老，而TPPU在体外挽救ROS诱导的细胞衰老
3、14,15-EET通过抑制EM中PI3K/AKT/mTOR信号通路的过度激活来减轻GC衰老
对EM-mGCs和Con-mGCs的卵巢GCs进行RNA测序，基因集富集分析显示，与 Con-mGCs相比，EM-mGCs中衰老和细胞衰老相关基因集显著富集，同时PI3K-Akt信号通路和mTOR信号通路被显著激活。为明确PI3K/AKT/mTOR通路在14,15-EET抗衰中的核心作用，在14,15-EET预处理并诱导氧化应激的mGCs中，使用AKT特异性激活剂 SC79重新激活 AKT。结果显示，SC79 处理后，衰老标志物蛋白表达水平显著回升，细胞衰老表型再次出现，证实14,15-EET对GC衰老的缓解作用依赖于对PI3K/AKT/mTOR通路的抑制。进一步用14,15-EET处理EM来源的mGC后，RNA-seq和KEGG分析显示，PI3K-AKT信号通路的富集程度显著降低。Western blot验证，在氧化应激条件下，14,15-EET预处理能有效抑制PI3K p85、p-AKT和p-mTOR的过度激活。这些结果共同表明PI3 K/AKT/mTOR信号通路在EM相关不育中的重要作用，这意味着14,15-EET可能通过抑制EM-GC中该通路的过度激活而起作用。在EM小鼠模型及体外实验中，双靶点I类PI3K/mTOR抑制剂BEZ-235通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路过度激活，显著缓解GCs衰老，并改善COC扩张异常。
14,15-EET通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路过度激活挽救ROS诱导的mGC衰老
研究结论
本研究首次阐明ROS-EZH2/H3K27Me3-EPHX2-EET这一反馈环路形成了一个恶性循环，该循环可促进卵巢颗粒细胞衰老，并参与子宫内膜异位症相关不孕的发生发展。14,15-EET可通过抑制EM-GCs中PI3K-AKT-mTOR信号通路的异常激活，缓解颗粒细胞衰老并改善生育能力。